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DNA末端标记技术萤光素可在萤光显微镜下观察

信息分类:金相文章   作者:yiyi发布   时间:2011-11-7 0:26:44 将本页加入收藏

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DNA末端标记技术
由于核酸内切酶的作用,凋亡细胞DNA降解产生缺口和3-OH末端,所以在组织
切片或固定细胞上选用标记的DNA探针进行原位标记。其中一种方法称为原位
缺口转译(In situ nick translation),另一种方法为末端核苷酸转移酶介导的
dUTP末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-nediated dUTP nick
end labeling, TUNEL)。以上方法中,DNA片段的3-OH末端可在DNA聚合酶或
TdT作用下,用生物素(Biotin)、地高幸(Digoxin)、放射性核素(Radionuclide)或
萤光素(Fluorescein)连接的dUTP进行标记,生物素和地高辛标记可通过组织化学
法显示,放射性核素用放射自动显影,萤光素可在萤光显微镜下观察,也可以
流式细胞仪测定。TUNEL技术的敏感性更高。DNA末端标记技术的优点是:
(1)能够在组织切片上辨别形态学早期难以辨别的凋亡细胞;
(2)与流式细胞仪
(Flow cytometry)分析结合,可定量测定凋亡细胞的百分比;
(3)与免疫萤光染色
结合,可辨别不同细胞的凋亡情况。
流式细胞仪分析
流式细胞仪可从以下途径反映凋亡细胞的特性:
(1)DNA含量:由于DNA分子被降解,DNA特异性萤光染色减少。
(2)细胞膜的完整性:凋亡细胞的细胞膜始终保持完整,在细胞膜通透性处理前
不被碘化丙啶染色,坏死细胞则被染色;细胞膜通透性处理后再染色时,凋亡
细胞的萤光强度低于正常细胞。因此,运用不同的核酸染色可区分凋亡细胞、
坏死细胞和正常细胞。
(3)粒线体与溶酶体:凋亡细胞的粒线体跨膜电位仍然存在,因此可滞留染料
Rhodamine 123。凋亡细胞保持了ATP依赖性溶酶体质子帮浦活性。
(4)蛋白质:凋亡细胞中蛋白酶激活后,蛋白质含量减少,因而以
Sulforhodamine 101(SR 101)染总蛋白,凋亡细胞较正常细胞少,而坏死细胞仅
微量。
(5)凋亡细胞:凋亡细胞前向散射减少,侧向散射不变或升高。
利用流式细胞仪来检测凋亡细胞特性的方法有:
(一)亚G1峰的检测法
处于增殖周期的细胞,根据其所处不同周期时期(G0/G1、S和G2/M),其DNA含
量分布在2n~4n之间。发生细胞凋亡的细胞由于细胞核内DNA裂解成许多小片
段,在酒精固定后,用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过细胞膜而丢
失,仅剩下大片段DNA这些失去部分DNA含量的细胞,在DNA染色后,形成一
个DNA含量小于2n(即小于G1时期细胞)的分布区,称为亚G1峰。
在经诱导后产生凋亡的细胞,在其DNA含量的组方图(Histogram)上,在G1峰前
会出现一个呈高斯分布的峰,即为亚G1峰,从分析峰的百分比即可得出凋亡细
胞的百分比。而在正常细胞或会自发性产生细胞凋亡的细胞,其亚G1峰的百分
比不会超过5%。另外,发生坏死的细胞或机械性损伤的细胞在G1峰前不会呈现
高斯分布的亚G1峰,但可出现一个连续的DNA小片段分布曲线,以此就可和细
胞凋亡区分开来。
(二)末端转移酶标记技术
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活,细胞核DNA被切割成许多双股
DNA片段以及高分子量DNA断裂点(缺口),暴露出大量3’-OH末端,如果用带有
绿色萤光(FITC)的末端转移酶和带有红色萤光(PI)来将细胞染色,这种带有双重
萤光讯号的细胞经流式细胞仪分析后,则可显示出不同细胞周期时期的细胞凋
亡情况。
在利用此测定方法和经流式细胞仪分析后,凋亡细胞的表现为可被PI和FITC同
时染色,而未进行细胞凋亡的细胞仅会被PI染上萤光,因此可利用这样方式将
凋亡的细胞和非凋亡的细胞区分开。

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